Cre-Loxp 系统是基因功能研究中实现定点敲除的核心工具，其应用可靠性直接依赖于规范的模型鉴定与对系统特性的精准把握。本文基于实验实操经验，系统梳理 Flox 模型鉴定、CKO 模型敲除检测、常见问题排查及 Cre 表达特性把控等关键内容，为科研人员提供标准化参考。

一、Flox 模型基因鉴定核心方案

（一）鉴定原理

Flox 等位基因（fl）相较于野生型（wt），除含 Loxp 位点外，还插入 80-100bp 外源序列（如酶切位点、公用引物序列）。通过设计特异性引物，借助 PCR 扩增可区分不同基因型。

（二）引物设计策略

采用 “两端鉴定” 方案，在 Flox 区域的 5' 臂和 3' 臂分别设计引物（如 5' 臂的 F1、R1 引物），引物靶向插入序列两侧的同源序列，确保鉴定特异性。

（三）基因型判断标准

· wt/wt 基因型：仅扩增出 wt 条带；

· fl/fl 基因型：仅扩增出 fl 条带（比 wt 条带大 80-100bp）；

· fl/wt 杂合子：同时出现 wt 条带与 fl 条带。

flox小鼠各基因型对应的凝胶电泳结果示意图

（B: Blank control; M: Marker）

二、CKO 模型基因敲除检测方法

（一）检测原理

获得 Flox 纯合且 Cre 阳性小鼠（fl/fl;T）后，需验证目的基因在特定组织中的敲除效果。采用 “null 引物”（如 F1/R2）设计在 Flox 区域两端，若发生敲除，将扩增出变短的 null 条带，提示 Flox 区域已被切除。

（二）关键注意事项

Cre-Loxp 系统的敲除效率并非 100%，同一组织中可能同时存在已敲除和未敲除细胞，PCR 结果若出现 fl/null 条带共存，属于正常现象。

三、基因组 DNA 提取方法选择

高质量基因组 DNA 是 PCR 鉴定准确的前提，推荐三种常用方法，可根据样本类型、通量及下游应用选择：

1. 酚 - 氯仿法：传统有机溶剂提取法，适用于多种组织类型，DNA 纯度高，但操作步骤繁琐；

2. 商业试剂盒法（如 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit）：基于柱式纯化技术，操作简便快速，适合高通量样本处理，能减少污染；

3. 盐析法：通过高盐浓度沉淀 DNA，成本低、速度快，适用于鼠尾等小组织样本，纯度略低于前两种方法。

注：鼠尾组织提取 DNA 时，优先选择商业试剂盒法或盐析法，可获得更稳定的结果。

四、常见问题解析与应对

（一）fl/wt 样本出现三条带

· 可能原因：非特异性扩增，或 PCR 过程中 fl 与 wt 基因形成空泡状结构导致电泳速度减慢；

· 应对方案：优化 PCR 程序（如调整退火温度），减少非特异性结合。

（二）CKO 模型条带大小与预期不符

· 核心原因：Flox 与 wt 条带的大小差异源于 80-100bp 的外源插入序列，而非 34bp；

· 应对方案：使用高分辨率 DNA Marker，同时设置 wt 对照，确保条带判断准确。

（三）是否可仅用一端引物鉴定？

不建议。商业机构提供的基因编辑模型通常经过两端鉴定，以排除染色体交叉互换等低概率事件；后代鉴定中保持两端鉴定方案，能提升结果严谨性。

五、Cre 生殖系统泄露表达的影响与应对

（一）核心影响

部分启动子驱动的 Cre 可能在生殖系统泄露表达，导致非预期全身性敲除，影响繁育结果（如无法获得 fl/fl;T 小鼠）。例如 Prrx1 启动子驱动的 Cre，在肢芽表达的同时，生殖细胞中也存在活性。

（二）Cre 组织表达信息确认方法

1. 查询品系参考文献或 MGI 数据库；

2. 将 Cre 品系与荧光报告基因工具鼠配繁，通过报告基因表达情况判断 Cre 活性。

（三）泄露表达判断方式

使用 F2/R2 引物（设计在 Flox 区域上下游）检测鼠尾 DNA，可判断是否存在生殖系统泄露导致的子代全身敲除。

（四）泄露机制

以精子为例，Cre 在精子中表达会介导 Flox 区域剪接为 null 基因，该 null 基因通过遗传导致子代全身表达。

六、实验核心总结

1. Flox 模型鉴定需采用两端引物方案，关注条带大小差异，必要时优化 PCR 程序；

2. CKO 模型敲除效率非 100%，部分组织可能出现混合条带，属正常现象；

3. 严格把控 Cre 表达特性，通过查询数据库或配繁报告鼠确认组织特异性，避免生殖系统泄露导致实验偏差。

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