骨质疏松症药物的临床前评价：动物模型与药效验证

卵巢切除模型、人源RANKL转基因模型与地舒单抗药效数据

骨质疏松症以骨量减少、骨微结构退化和骨强度下降为主要特征，多见于绝经后女性和老年人。患者在骨折前往往没有明显症状，轻微跌倒也可能引发脆性骨折，常见部位包括椎体、髋部和腕部。椎体压缩性骨折可表现为背痛、身高缩短或驼背［1］。

骨丢失源于骨重塑失衡。当破骨细胞吸收的骨组织超过成骨细胞形成的新骨，骨量就会逐步下降。绝经后雌激素水平下降可加速骨吸收，衰老则常伴随骨形成能力减弱［2］。现有药物作用于骨重塑的不同环节。阿仑膦酸钠等双膦酸盐和地舒单抗（Denosumab）主要抑制骨吸收，其中地舒单抗通过阻断核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand，RANKL）发挥作用［3，4］。特立帕肽主要促进骨形成，罗莫索单抗通过抑制硬化蛋白，在促进骨形成的同时降低骨吸收［5，6］。

美国食品药品监督管理局在2019年发布的非临床评价指南中提出，骨质量研究应根据拟开发的临床适应症选择动物模型。针对绝经后骨质疏松，指南通常建议采用卵巢切除术（Ovariectomy，OVX）大鼠，并配合一种皮质骨重塑更活跃的大型非啮齿类OVX动物开展研究。对于具有物种特异性的生物制剂，可根据药理反应选择相关物种。缺乏相关物种时，可考虑采用表达人源靶点的转基因模型［7］（图1）。

图1 骨质疏松症候选药物的非临床骨质量评价流程

这张图展示了骨质疏松症药物的非临床骨质量评价流程，以拟开发的临床适应证为起点，聚焦药物对骨量、骨结构和骨强度的影响。流程分为四个核心步骤，依次为01动物模型选择、02给药方案设计、03给药与随访、04骨质量综合评价。每个步骤均标注了具体内容，其中动物模型选择需选适合适应证的成熟动物，给药方案需确定有效剂量及给药时长、骨量型周期，给药与随访需进行基线评估并检测骨转换指标，骨质量综合评价则涵盖骨量与骨密度、骨结构与组织形态、骨力学、骨转换四个评价维度。图中还提及该评价流程的参考依据，最终部分补充说明绝经后骨质疏松申报常用OVX大鼠及较大的OVX非啮齿动物，还明确了参考的FDA指南编号为Ⅱ.B-C-Ⅶ。

在候选药物的体内药效研究中，集萃药康以OVX模型和人源RANKL转基因模型为基础，根据拟开发适应症和药物作用机制确定给药窗口与主要终点，并结合骨微结构、骨力学和骨转换指标评价药效。对于靶向人源蛋白的抗体，还需确认候选分子能否识别模型中的靶蛋白，并产生预期的功能效应。

01 卵巢切除模型及骨丢失表型

OVX小鼠和OVX大鼠可用于模拟绝经后雌激素缺乏相关的骨丢失。预防性研究可在术后早期开始干预。治疗性研究可先通过活体micro-CT或独立造模批次确认目标骨部位已出现骨丢失，再启动给药。造模和给药窗口应结合动物年龄、目标骨部位和预设主要终点确定［7，8］。

OVX小鼠骨质疏松模型

选用8周龄雌性C57BL/6JGpt小鼠，随机分组后对模型组实施OVX，术后第10周为试验终点。方案记录体重和子宫重量，并于终点通过Micro-CT评价骨微结构。

与假手术组相比，OVX组体重增幅更大，子宫重量与体重之比显著降低。（图2）

图片展示了OVX小鼠的体重变化及子宫重量与体重之比情况。左侧折线图显示体重随时间变化，黑色点线为第0天体重。中间折线图呈现体重变化率，黑色点线为0%。右侧柱状图对比G1:Sham和G2:OVX组子宫重量与体重比，G2:OVX组显著低于G1:Sham组。该图与上下文对应，直观呈现了OVX小鼠体重增幅更大、子宫重量与体重之比显著降低的现象。

图2 OVX小鼠的体重变化和子宫重量与体重之比。从左至右依次为体重、相对第0天的体重变化率和子宫重量与体重之比。数据为均值 ± SEM，每组12–16只。子宫重量与体重之比采用t检验，\*\*\*\* P < 0.0001。

代表性Micro-CT图像显示，OVX组松质骨ROI（Region of Interest）的骨小梁较假手术组稀疏。（图3）

这张图片是骨质疏松症药效验证研究中，OVX小鼠与假手术组（Sham）松质骨的代表性Micro-CT图像，对应文档中介绍的图3。图片分为上下两部分，上方为假手术组，下方为OVX组，每行从左至右分别展示了股骨的冠状位视图、矢状位视图，以及松质骨感兴趣区（ROI）的冠状位和横断位视图。对比可见，OVX组的松质骨ROI区域骨小梁较假手术组明显稀疏，直观呈现了卵巢切除诱导小鼠骨丢失的典型表型，为该模型用于骨质疏松症药物评价提供了可视化依据。

图3 OVX小鼠松质骨的代表性micro-CT图像。上排为假手术组，下排为OVX组。从左至右依次为冠状面、矢状面、松质骨ROI冠状面和横断面。

术后第10周，OVX组股骨松质骨的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、数量（Tb.N）、骨密度（BMD）和骨矿物质含量（BMC）均显著降低，骨小梁间距（Tb.Sp）显著增大。（图4）

图4为OVX小鼠股骨松质骨的Micro-CT定量分析结果，包含6组柱状对比图，每组均对应G1:Sham假手术组（黑色柱）与G2:OVX去卵巢模型组（青绿色柱）。在骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨密度（BMD）、骨矿物质含量（BMC）这5项指标中，OVX组的数值均显著低于假手术组，而骨小梁间距（Tb.Sp）指标的OVX组数值显著高于假手术组。所有对比项上方均标注有“****”，表示两组间差异具有统计学意义，该结果直观展现了卵巢切除后小鼠出现的典型骨质疏松骨丢失表型。

图4 OVX小鼠股骨松质骨Micro-CT定量分析。数据为均值 ± 均值标准误（SEM），每组12–16只。与假手术组比较，采用t检验，\*\*\*\* P < 0.0001。

胫骨松质骨呈现同方向变化。与假手术组相比，OVX组的骨体积分数、骨小梁厚度、数量、骨密度和骨矿物质含量均显著降低，骨小梁间距显著增大。（图5）

图5为OVX小鼠胫骨松质骨的Micro-CT定量分析结果，分为6组柱状图，用于对比假手术组（G1:Sham）与卵巢切除模型组（G2:OVX）的骨相关指标。6项指标分别为骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间距（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）、骨矿物质密度（BMD）、骨矿物质含量（BMC），每组均对应黑色柱（假手术组）与绿色柱（OVX模型组），每组样本量为12至16只。所有指标均显示假手术组数值高于OVX组，且两组间差异极显著，标注有****，对应的统计学P值小于0.0001，体现出卵巢切除后小鼠出现了典型的骨丢失表型。

图5 OVX小鼠胫骨松质骨Micro-CT定量分析。数据为均值 ± 均值标准误（SEM），每组12–16只。与假手术组比较，采用t检验，\*\*\*\* P < 0.0001。

股骨纵切片的代表性图像显示，OVX组部分视野内骨小梁分布较假手术组稀疏。（图6）

图片展示了OVX小鼠股骨纵切片的苏木精 - 伊红（HE）染色结果。从左至右依次为假手术组、OVX术后4周及术后8周的两个代表性视野。假手术组骨小梁分布较为密集；OVX术后4周组部分视野内骨小梁分布较假手术组稀疏；OVX术后8周组骨小梁分布进一步稀疏，部分区域骨小梁消失。该图与上下文紧密相关，直观呈现了OVX小鼠骨质疏松模型的骨丢失表型。

图6 OVX小鼠股骨纵切片的苏木精–伊红（HE）染色。从左至右依次为假手术组、OVX术后4周及术后8周的两个代表性视野。

OVX大鼠骨质疏松模型

在大鼠试验中，OVX组术后体重增幅高于对照组。（图7）

图片为OVX大鼠术后体重变化图，横轴为试验天数，纵轴为体重（g）。G1为对照组，G2为OVX组。图中显示，术后第10周，OVX组大鼠体重增幅高于对照组，且在D7、D14、D21、D28、D35、D43、D49、D51、D56、D65、D73天时，OVX组体重均高于对照组。该图与上下文紧密相关，直观呈现了OVX大鼠术后体重变化情况，与上下文提到的术后体重增幅高于对照组相呼应。

图7 OVX大鼠术后体重变化。G1为对照组，G2为OVX组。横轴为试验天数。

术后第10周，与假手术组相比，OVX大鼠松质骨骨密度和骨小梁数量显著降低，骨小梁间距显著增大。（图8）

图片展示了OVX大鼠骨组织的代表性Micro-CT图像及定量分析。左上为对照组，左下为OVX组，右上为对照组定量结果，右下为OVX组定量结果。定量分析包括Whole BMD、Ost BMD、Intra BMD、Tb BMD、BV/TV、Tb N、Tb Sp、Tb Th等指标，数据以均值±SEM呈现，每组3 - 5只，采用t检验，具体P值在图中未给出。该图与上下文紧密相关，直观呈现了术后第10周OVX大鼠与假手术组在骨组织方面的差异。

图8 OVX大鼠骨组织的代表性Micro-CT图像及定量分析。图左为对照组和OVX组的代表性图像，图右为定量结果。数据为均值 ± SEM，每组3–5只，采用t检验，具体P值见图。

药康生物正进一步开展OVX小鼠和大鼠模型的特立帕肽阳性对照试验，评价模型对促骨形成药物的响应，为不同作用机制候选药物的临床前药效研究提供更多参考。相关药效数据敬请期待。

02 人源RANKL转基因模型及地舒单抗药效

已发表研究显示，地舒单抗可在表达嵌合人/鼠RANKL的敲入小鼠中抑制骨吸收［9］。集萃药康对B6-hRANKL-Tg小鼠（T004163）开展了分周龄骨表型评价，并在雌鼠联合OVX模型中考察地舒单抗的体内药效。

雄性B6-hRANKL-Tg小鼠的骨表型

选用8周龄雄性B6-hRANKL-Tg小鼠和同龄雄性B6对照小鼠。两种品系分别随机分为3组，每组6只，于8、12和16周龄分别取材并进行Micro-CT检测。

观察期间，雄性转基因小鼠与同龄B6对照小鼠的体重及体重增长趋势相近。（图9）

图片展示了雄性B6-hRANKL-Tg小鼠及B6对照小鼠的体重变化情况。左侧为体重变化折线图，横轴为天数，纵轴为体重（g），不同颜色线条代表不同组别，如G1 - 1: B6、G2 - 1: B6等，各组体重随时间呈上升趋势。右侧为体重变化率折线图，横轴为天数，纵轴为体重变化率（%），各组体重变化率也随时间呈上升趋势。该图与上下文提到的观察期间雄性转基因小鼠与同龄B6对照小鼠体重及增长趋势相近的内容相关。

图9 雄性B6-hRANKL-Tg小鼠及B6对照的体重变化。左图为体重，右图为相对第0天的体重变化率，每组6只。

在8、12和16周龄，转基因小鼠股骨松质骨的骨体积分数和骨小梁数量均低于同龄B6对照，骨小梁间距均较大。骨密度和骨矿物质含量的组间差异主要见于8和12周龄，骨小梁厚度在12和16周龄较高。（图10）

这是标题为《图10雄性B6-hRANKL-Tg小鼠股骨松质骨Micro-CT定量分析》的结果图，由6幅子图组成，展示了雄性B6（黑色线）与B6-hRANKL-Tg（青色线）小鼠在8周、12周、16周的骨相关指标对比。各子图分别对应不同指标：BV/TV（骨体积分数）、Tb.Th（骨小梁厚度）、Tb.Sp（骨小梁间距）、Tb.N（骨小梁数量）、BMD（骨密度）、BMC（骨矿物质含量），图中以星号标注组间差异的显著性水平，比如BV/TV的组间在各周龄均有显著差异，Tb.Sp、Tb.N的组间也呈现多水平的显著性差异。这些结果验证了人源RANKL转基因小鼠的骨相关特征，与文档中对应年龄段的对比结论相符。

图10 雄性B6-hRANKL-Tg小鼠股骨松质骨Micro-CT定量分析。各周龄比较转基因小鼠与同龄B6对照，每组6只。采用双因素方差分析（Two-way analysis of variance，Two-way ANOVA），因素为基因型和周龄。星号表示同一周龄两组间的比较结果：\* P < 0.05，\*\* P < 0.01，\*\*\* P < 0.001，\*\*\*\* P < 0.0001。

雌性B6-hRANKL-Tg小鼠联合OVX后的骨表型

选用8周龄雌性B6-hRANKL-Tg小鼠，随机分组后对模型动物实施卵巢切除术，分别在术后4周和8周取材。未手术的B6小鼠和B6-hRANKL-Tg小鼠分别在8、12和16周龄取材。各组进行micro-CT检测。

转基因小鼠接受OVX后体重增幅加大。术后4周，子宫重量与体重之比低于同龄未手术转基因小鼠。（图11）

这张图是雌性B6-hRANKL-Tg小鼠联合OVX后的体重和子宫重量变化相关结果，共包含三个可视化部分。从左至右依次为：左侧是体重随天数变化的折线图，中间是相对第0天的体重变化率随天数变化的折线图，右侧为子宫重量与体重之比的柱状图。图中对不同组别做了明确标识，涵盖了普通B6小鼠以及不同年龄、是否去势的hRANKL转基因小鼠的对应数据，每组有5到6只样本。

图11 雌性B6-hRANKL-Tg小鼠联合OVX后的体重和子宫重量变化。从左至右依次为体重、相对第0天的体重变化率和子宫重量与体重之比，每组5–6只。

与同龄B6对照相比，未手术转基因小鼠的股骨松质骨骨体积分数、骨小梁数量和骨矿物质含量较低，骨小梁间距较大。在12和16周龄，与同龄未手术转基因组相比，联合OVX组的骨体积分数、骨小梁数量和骨矿物质含量进一步降低，骨小梁间距进一步增大。（图12）

图片展示了雌性B6-hRANKL-Tg小鼠联合OVX后的股骨松质骨Micro-CT定量分析结果。包含BV/TV（骨体积分数）、Tb.Th（骨小梁厚度）、Tb.Sp（骨小梁间距）、Tb.N（骨小梁数量）、BMD（骨矿物质密度）和BMC（骨矿物质含量）等指标的对比。8周龄时，B6-hRANKL-Tg组和B6-hRANKL-Tg -OVX组在各指标上差异不显著；12周龄和16周龄时，B6-hRANKL-Tg -OVX组各指标数值均低于B6-hRANKL-Tg组。该图与上文提到的12和16周龄联合OVX组骨表型降低等结果相呼应。

图12 雌性B6-hRANKL-Tg小鼠联合OVX后的股骨松质骨Micro-CT定量分析。OVX术后4周和8周分别对应12和16周龄，每组5–6只。

地舒单抗在雌性B6-hRANKL-Tg联合OVX模型中的药效

选用8–10周龄雌性B6-hRANKL-Tg小鼠，随机分组后对模型动物实施卵巢切除术。术后第4周开始给予阳性对照药地舒单抗，剂量为10 mg/kg，每周皮下注射1次，连续给药6周。试验终点进行股骨micro-CT检测。

与模型对照组相比，地舒单抗组股骨松质骨的骨体积分数、骨小梁数量、骨密度和骨矿物质含量显著升高，骨小梁间距显著减小。骨小梁厚度未见显著变化。（图13）

图13展示了地舒单抗对B6-hRANKL-Tg联合OVX模型股骨松质骨的影响相关的实验数据，分为6组条形图，对应不同骨计量学指标。不同组别对应：G1为C57BL/6J组、G2为B6-hRANKL-Tg + OVX模型对照组、G3为B6-hRANKL-Tg + OVX经地舒单抗（10mg/kg，皮下注射、每两周1次共6周）给药组。各指标包括BV/TV、Tb.Th等，以均值±SEM呈现，每组样本量为6，统计采用单因素方差分析及Dunnett多重比较，标注的*P值代表与模型对照组的统计学差异，其中*、**标识的差异极为显著，*、**标识也对应显著差异，反映出地舒单抗干预后相关骨指标的变化情况。

图13 地舒单抗对B6-hRANKL-Tg联合OVX模型股骨松质骨的影响。数据为均值 ± SEM，每组6只。采用单因素方差分析及Dunnett多重比较，与模型对照组比较。\* P < 0.05，\*\* P < 0.01，\*\*\* P < 0.001，\*\*\*\* P < 0.0001。

SD-hRANKL大鼠的骨表型

与野生型SD大鼠相比，SD-hRANKL大鼠（T002583）的代表性micro-CT图像显示，松质骨区域内可见骨小梁减少，骨小梁网络更稀疏。（图14）

图片展示了SD-WT（野生型）和SD-hRANKL（人源RANKL转基因）大鼠的代表性micro-CT图像。左列为SD-WT大鼠，右列为SD-hRANKL大鼠，每组图像包含上下两部分。白色箭头所指区域为对比观察区域，用于直观呈现松质骨区域的骨小梁变化。与SD-WT大鼠相比，SD-hRANKL大鼠松质骨区域内骨小梁减少，骨小梁网络更稀疏，与上下文提到的SD-hRANKL大鼠骨表型特征相呼应。

图14 SD-hRANKL大鼠的代表性micro-CT图像。左列为野生型SD大鼠，右列为SD-hRANKL大鼠。白色箭头指示对比观察区域。

骨组织HE染色显示，SD-hRANKL大鼠的骨小梁排列疏松、数量减少，部分区域仅见少量残存骨小梁。（图15）

图片展示了SD-WT和SD-hRANKL大鼠的骨组织HE染色结果。左上角为SD-WT大鼠，左下角为SD-hRANKL大鼠，右上角和右下角为对应大鼠的放大图。SD-WT大鼠骨小梁排列紧密，而SD-hRANKL大鼠骨小梁排列疏松、数量减少，部分区域仅见少量残存骨小梁。黑色箭头指示骨小梁，红色箭头指示脂肪细胞，黑色三角形指示骨小梁近乎消失的区域。该图与上下文内容对应，直观呈现了SD-hRANKL大鼠骨表型特征。

图15 SD-hRANKL大鼠骨组织HE染色。上排为野生型SD大鼠，下排为SD-hRANKL大鼠。黑色箭头指示骨小梁，红色箭头指示脂肪细胞，黑色三角形指示骨小梁近乎消失的区域。

在观察到SD-hRANKL大鼠的松质骨丢失表型后，药康生物正在以地舒单抗为阳性对照，评估抑制人源RANKL后骨量和骨小梁微结构的变化。该试验将为后续使用这一大鼠模型评价靶向人源RANKL的候选抗体提供药效参照。

03 骨微结构与骨力学的联合评价

主要药效终点应根据候选药物的作用机制、模型表型和目标骨部位预先确定。以松质骨保护为主要目标时，可选用股骨远端micro-CT测得的骨体积分数作为主要终点，并结合骨小梁数量、厚度和间距描述结构变化。若关注皮质骨反应，可在股骨骨干中段测定皮质骨厚度和横截面积。组间比较应统一ROI的位置、范围和图像分析方法［10］。

骨力学试验用于测定骨骼在指定加载条件下的承载和变形特性。股骨三点弯曲主要评价骨干的整体弯曲性能，可从力–位移曲线获得最大载荷、刚度等指标，并结合股骨中段皮质骨几何参数解读。若研究重点为椎体承载能力，可将腰椎micro-CT与椎体压缩试验配合使用，在同一解剖部位分析结构与力学表现［11］。

针对促骨形成或抑制骨吸收的机制假设，可将血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽（P1NP）和Ⅰ型胶原羧基端交联肽（CTX-I）作为辅助指标［12］，并按研究需要结合骨组织形态计量，分析骨转换变化与结构及力学结果之间的关系。

项目合作

药康生物可围绕候选药物当前需要回答的问题设计体内药效试验。从早期验证靶点相关的药理活性，到比较不同剂量下的骨保护效果，我们结合药物作用机制、物种交叉反应和模型表型，协助确定动物模型、阳性对照和给药窗口。在方案阶段同步规划检测部位、取材时间和样本分配，使骨微结构、骨力学和骨转换数据能够结合解读，为候选分子筛选和后续剂量选择提供依据，助力骨质疏松症相关药物的临床前开发。（图16）

图16为集萃药康的骨质疏松症动物模型及药效验证进展表格，对比了四种骨质疏松症模型的相关信息。表格从对比维度、骨丢失机制、表型特点、主要用途、阳性药验证五方面，介绍了OVX小鼠、B6-hRANKL-Tg联合OVX小鼠、OVX大鼠、SD-hRANKL-Tg转基因大鼠的对应特征：OVX小鼠由雌激素缺乏引发骨吸收超过骨形成，术后约10周骨丢失明显，可用于抗骨吸收和成骨药物筛选；B6-hRANKL-Tg联合OVX小鼠的骨丢失机制叠加了人源RANKL促进骨吸收，可用于抗hRANKL抗体药的评价研究；OVX大鼠术后约10周骨丢失明显，药效兼具兼顾皮质骨分析和骨力学测试；SD-hRANKL-Tg转基因大鼠因人源RANKL过表达自发出现骨丢失，可用于抗hRANKL抗体药的骨皮质分析与骨力学测试，且地舒单抗在该模型中已验证有效，表格下方还标注了OVX为卵巢切除术，hRANKL为人源RANKL。

图16 集萃药康骨质疏松症动物模型及药效验证进展

参考文献

［1］National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. Osteoporosis. https://www.niams.nih.gov/health-topics/osteoporosis

［2］National Institute on Aging. Osteoporosis. https://www.nia.nih.gov/health/osteoporosis/osteoporosis

［3］U.S. Food and Drug Administration. FOSAMAX (alendronate sodium) prescribing information. §12.1. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2026/020560s073lbl.pdf

［4］U.S. Food and Drug Administration. PROLIA (denosumab) prescribing information. §12.1. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2025/125320s219lbl.pdf

［5］U.S. Food and Drug Administration. FORTEO (teriparatide) prescribing information. §12.1. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2026/021318s059lbl.pdf

［6］U.S. Food and Drug Administration. EVENITY (romosozumab-aqqg) prescribing information. §12.1. https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2019/761062s000lbl.pdf

［7］U.S. Food and Drug Administration. Osteoporosis: Nonclinical Evaluation of Drugs Intended for Treatment. Guidance for Industry. 2019. https://www.fda.gov/media/129899/download

［8］Klinck J, Boyd SK. Calcif Tissue Int. 2008;83:70–79. doi:10.1007/s00223-008-9150-5.

［9］Kostenuik PJ, et al. J Bone Miner Res. 2009;24:182–195. doi:10.1359/jbmr.081112.

［10］Bouxsein ML, et al. J Bone Miner Res. 2010;25:1468–1486. doi:10.1002/jbmr.141.

［11］Jepsen KJ, et al. J Bone Miner Res. 2015;30:951–966. doi:10.1002/jbmr.2539.

［12］Bhattoa HP, et al. Osteoporos Int. 2025;36:579–608. doi:10.1007/s00198-025-07422-3.