CCK8实验是什么?

科研中,细胞毒性试验是必备的，利用细胞毒理学比较多种检测终点、不同组织和种属的预测能力，发现啮齿动物细胞系对啮齿动物急性毒性，人源细胞系对人体急性毒性均有良好的预测能力。细胞毒性是指由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性常用CCK-8检测法，毒性检测是最常见又很关键的细胞实验之一。

CCK-8实验原理:

CCK-8 试剂中含有 WST–8 ，它在电子载体的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

细胞毒性试验方法：CCK-8法检测细胞增殖和毒性分析

CCK8全称为cell counting kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。该试剂的关键组分是水溶性唑盐WST–8:化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

CCK-8法细胞毒性检测步骤：

1、首次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK8试剂后的培养时间;

2、接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接种几个孔就混匀一下;

3、悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞在加入CCK-8培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再确定;

4、 加CCK-8试剂时，斜贴着培养壁加，不要插到培养基液面下，容易产生气泡，会干扰O.D值读数;

5、为使CCK-8试剂和培养基充分混匀,建议在加入CCK-8试剂后轻轻振摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8试剂在枪头上的残留所带来的误差,可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样;

6、如果待测物质有还原性，就会和CCK-8试剂发生显示反应，增加吸光度，如果药物有氧化性则降低吸光度。请检查背景的OD值，即在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加CCK-8试剂),如果OD值明显偏高,则说明有反应，也可以在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物影响。

7、加入待测物质的浓度需要多参考文献，选择合适的浓度梯度进行筛选。

8、尽量使用多通道移液器，可以减少平行孔间差异。

9、如果样品为高浑浊度的细胞悬液，可以设定600nm作为参比波长，扣除参比波长的OD值。

活力计算公式

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值

A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值

A(空白)：没有细胞的孔的OD值

细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

CCK-8的优点

产生的甲瓒产物是水溶性的，无需换液，适合悬浮细胞

不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小

CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制，即开即用

灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好

操作简便，省时省力

适合于高通量药物筛选

CCK-8的缺点

与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵

CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易漏加或多加

CCK-8细胞毒性试验细节问题

问题一：CCK 的保存和稳定性如何?

答：CCK 稳定性高，避光条件-20℃ 有效期2 年，4℃ 有效期 1 年。经常使用建议4℃ 保存，避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。

问题二：CCK会对活细胞进行染色吗?

答：不会，首先WST-8不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。

问题三：在加入CCK-8时可否不更换培养基?

答：一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。

问题四：若是使用6孔或者24孔板进行试验，CCK 试剂使用量怎么样呢?

答：如果要使用6孔板或24孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。

问题五：能否用384孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢?

答：可以，CCK-8产品的使用量为每孔培养基总体积的 10%。建议先将CCK-8产品稀释一倍，然后加入培养基总体积的20% 即可，这样可减少误差。

问题六：只可以在450 nm 波长处测OD值吗?

答：可以在450 nm 波长处测OD值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在430~490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最 高。

问题七：若是暂不检测OD值，该如何处理?

答：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M 的HCl 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化

问题八： 在实验中OD值太高，怎么解决?

答：可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。

问题九：如果OD值太低，怎么解决?

答：可以采取2 个办法：1、适当增加细胞数量;2、延长加入 CCK-8 试剂后的反应时间。

问题十：应该每次做标准曲线吗?

答：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。