实验室小鼠基因型鉴定方法|pcr鉴定小鼠基因型流程
对小鼠进行基因型鉴定是实验动物中心表型分析平台提供的常规服务，以确保实际使用的小鼠的基因型与预期一致，常用方法之一是使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)对基因工程小鼠的基因型鉴定。
常用小鼠基因型鉴定方法原理和应用：
鉴定方法 | 原理 | 应用场景 |
标准PCR方法 | 根据PCR产物的分子量差异(通常需大于100 bp)进行基因型鉴定。 | 鉴定基因工程小鼠的基因型，通常可以根据扩增条带的情况区分野生型，杂合子和纯合子。 |
qPCR | 通过CT值计算，对目的片段进行定量分析，也可以比较不同品系间同一片段的量。 | 区分半合子和纯合子转基因小鼠；鉴定转基因拷贝数 |
探针/终点分析(Probe/Endpointanalysis) | 使用Tagman 探针检测PCR产物中不同探针的荧光强度并作散点图。鉴别不同PCR产物片段进而进行基因型鉴定。 | 区分野生型，杂合子和纯合子;适用于扩增片段较短，或片段间差异较小(琼脂糖电泳无法区分)的情况，也可用于点突变的鉴定。 |
测序法 | 通过引物扩增出目标片段后进行测序。 | 常用于点突变的鉴定。 |
需要进行基因型鉴定情况：
1、新引进的小鼠：在订购的小鼠抵达设施后,建议第 一时间对引进小鼠进行鉴定，以确保无误。
2、繁育对：为保障子代基因型的正确性，建议对所有繁育对进行鉴定。
3、子代小鼠：如果亲本产生的后代仅有一种基因型(纯合种群)，在确保繁育对基因型的情况下，通常无需再对子代小鼠进行鉴定;如果亲本产生的后代有两种及以上基因型(例如杂合子配杂合子)，通常需要对子代进行鉴定以明确个体的基因型。
小鼠基因型鉴定实验步骤：
1. 小鼠组织取材
2. 小鼠DNA提取(酒精沉淀法、膜吸附法、磁珠法等)
3. PCR
4. 电泳或测序
5. 胶图拍照等图像采集
6. 数据分析和报告整理
小鼠基因型鉴定实验常见问题及对策
常见问题 | 可能原因 | 对策 |
样本组与阳性对照组均无扩增条带 | 长期存储或存储条件不当导致试剂失活 | 使用新的试剂盒 |
引物质景问题 | 重新设计合成引物 | |
退火温度过高 | 建议每2℃℃为一个梯度降低退火温度，摸索最 佳条件 | |
延伸时间过短或循环数过少 | 适当增长延伸时间或提高循环数至36-40 Cycles | |
样本组无扩增条带而阳性对照组正常 | 未充分消化组织样本 | 将消化时间延长至30 min |
加入过多模板抑制PCR | 降低模板用量 | |
未完全灭活蛋白酶活性 | 消化产物在95℃C加热5 min | |
有非特异性扩增条发 | PCR引物错配 | 重新设计PCR引I物 |
PCR体系配制不当(引物浓度或DNA模板浓度过高) | 适当降低引物和模板用量 | |
PCR反应条件设置不当(退火温度过低或循环数过高) | 适当提高退火温度或降低循环数 | |
配制PCR体系时环境温度过高或体系配制完成到PCR仪反应间隔时间过久 | 在冰浴环境下配制PCR反应体系，完成后尽快放入PCR仪中开始反应 | |
阴性对照出现目的条带 | PCR试剂或操作工具污染 | 使用新的试剂，重新高压灭菌ddH20和PCR用品。操作过程中动作尽量轻柔，避免加样溅出污染其他样品 |
实验结果重复性不好 | 试剂活性不稳定或DNA模板降解 | 低温保存所有试剂，重新提取样本基因组DNA |
样本DNA交叉污染 | 建议每个取样器只取一个样本，或取完一个样本后，将取样器刃口浸没在75%酒精或2%次氨酸钠溶液中反复涮洗，用干净的纸巾擦干后，再取下一个样本 | |
PCR产物交叉污染 | 操作过程中动作尽是轻柔，避免管中PCR产物溅出污染其他样品，电泳上样过程中，小心加入适是PCR产物到相应泳道中，避免上样过多溢出或动作过大而污染相邻泳道样品。注意勤换枪头以避免,产物交叉污染 |