我们的日常生活中潜伏着各种各样的病原体，为了守卫机体的健康，获得性免疫系统通过抗体多样化过程产生数以亿计的抗体分子，特异性地对抗入侵的病原体。

片段插入和缺失是低频有害的基因组DNA突变，片段插入促进互补决定区3（CDR3）的多样化对于靶向病毒的广泛中和和多反应性抗体的抗原结合功能至关重要，这是免疫球蛋白多样化的关键步骤。众所周知，片段插入或缺失很难被发现，因此很难定义这一过程中涉及的机制，由于检测这些低频事件存在挑战，在抗体多样化过程中产生的片段插入或缺失的机制仍然知之甚少。

2023年3月，上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀团队在SCIENCE IMMUNOLOGY上发表了题为“DNA repair mechanisms that promote insertion-deletion events during immunoglobulin gene diversification”的文章。该研究采用集萃药康小鼠T008150 Polb-flox(C57BL/6JGpt-Polbem1Cflox/Gpt)，揭示了±1bp和>1bp缺失或插入产生机制的差异。在此基础上，通过外切酶或聚合酶的遗传学操作获得了能够增加抗体基因缺失或插入的小鼠模型，为广谱中和抗体的筛选提供了新的思路和方法。

该研究的亮点是开发了一种乘客抗体基因（Passenger-Ig）系统并结合超深度测序解决了前人无法检测低频片段缺失或插入的困难。乘客抗体基因系统可以这样理解，出租车是B细胞，车内有司机和乘客。司机是负责驱动B细胞生存的功能性等位基因，而乘客则是不负责编码抗体的等位基因，只用观察和体验车内外的环境，因此可以不受外界干扰，真实记录所有发生的事件。

DNA片段缺失或插入是基因组中单个或多个核苷酸的缺失或插入，在免疫球蛋白即抗体的基因可变区外显子中，片段缺失或插入(<50 bp)通常会导致B细胞受体编码错误。罕见抗病毒广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody, bnAbs)获得广谱中和能力关键在于长片段缺失或插入。例如，抗体与HIV包膜三聚体表位的结合力可以通过抗HIV广谱中和抗体基因上的片段插入的途径来提高。本研究利用一种抗体无功能等位基因系统，同时结合超深度测序克服了片段缺失或插入检测的困难，成功捕捉到生理条件下真实的片段缺失或插入事件（图1）。

图1.小鼠模型与实验设计流程

作者通过对片段缺失或插入图谱的分析发现±1bp缺失或插入发生最频繁，占总缺失或插入事件的45%左右（图2）。对>1bp碱基插入的序列特征进行分析发现大部分的碱基插入为邻近序列的复制插入。发生在CDR3上的复制插入能够增加CDR3的长度，可能促进广谱中和抗体的产生。

图2.抗体无功能等位基因上1bp和>1bp缺失或插入的占比

在体细胞高频突变（Somatic Hypermutation, SHM）过程中，会伴随着胞苷脱氨酶AID作用于抗体可变区基因的变化，导致DNA损伤。碱基切除修复途径（base excision repair, BER）或错配修复途径（mismatch repair, MMR）可以修复这些损伤，从而产生碱基突变以及DNA片段的缺失或插入。为了探究DNA片段缺失或插入产生的分子机制，本研究在抗体无功能等位基因小鼠模型基础上构建了15种具有代表性的DNA损伤应答修复因子缺陷小鼠模型（图1），并对其片段缺失或插入图谱进行了系统的描绘（图3）。研究发现±1bp与>1bp缺失或插入产生的分子机制截然不同（图3-4），1bp缺失通过BER途径产生，1bp插入既可以通过BER途径产生，也可以通过MMR途径产生，产生过程需要核酸外切酶ExoI和易错DNA聚合酶Polη的参与。>1bp缺失或插入都是通过BER途径产生的，并且都需要DNA双链断裂损伤修复因子53BP1的参与。此外，>1bp插入还需要非同源末端连接途径和DNA聚合酶Polλ的参与。对片段缺失或插入分子机制的全面解析有助于理解广谱中和抗体产生的机制，为广谱中和抗体的生产提供了新的思路，为HIV等疫苗的设计提供了新的理论基础。

图3.抗体基因SHM中DNA片段缺失或插入机制的系统解析

作者在机制研究基础上，本研究成功构建了能够增加抗体基因缺失或插入频率的小鼠模型（图3），核酸外切酶Trex2过表达的小鼠模型能够促进片段缺失的产生，DNA聚合酶Polβ条件性敲除的小鼠模型能够促进片段插入的产生。这两种小鼠模型可以与人源化抗体小鼠模型联合使用，用于疫苗的研发和广谱中和抗体的生产。

图4.抗体基因SHM中DNA片段缺失或插入机制的系统解析

作者克服了低频事件检测挑战，通过独特的乘客抗体基因(Passenger-lg)系统剖析了体细胞高频突变过程中抗体基因片段插入或缺失的产生机制，并通过遗传学手段获得了能够提高片段缺失或插入频率的小鼠模型，为加速广谱中和抗体的产生提供了理论支撑。