基因点突变小鼠作用：

在目的基因上引入点突变，对于疾病模型的建立具有重大的意义，如候选点突变是基因疾病相关的人类基因SNP，对目标基因的候选位点进行点突变，若动物模型上再现了该疾病的性状，则建立的小鼠模型可以为精准治疗提供模拟人类疾病的动物模型。

　　1、引入基因突变;

　　2、使蛋白的功能域失活(酶的催化部位、结合部位);

　　3、点突变模型有很多潜在的应用，包括研究突变与人类某些疾病的因果关系。

点突变(Cas9-PM)构建定点敲入小(大)鼠技术流程图：

CRISPR-Cas9 PM策略示意图

点突变细胞系的构建分为三个部分：

1. 定点切割DNA

　　由于在自然界中DNA的断裂是随机的，不确定的，因此我们需要人为的定点对DNA产生切割。在这个过程中，CRISPR/Cas9技术给我们提供了极大的便利。我们可以通过人为的设计sgRNA，并将Cas9蛋白与sgRNA一起转染到目的细胞中。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割，产生DNA双链断裂。

2. 同源重组修复DNA

　　我们通过CRISPR/Cas9技术对细胞内的基因组DNA产生了双链断裂后，同时引发了细胞内的DNA修复机制。因此，为了使DNA在修复过程中能通过同源重组的方式修复DNA并引入突变位点，我们需要为细胞提供额外的同源修复模板。这个模板的本质是人为合成的DNA序列，由5’端同源臂、突变位点和3’端同源臂组成。值得注意的是，这种同源模板序列是随sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞的。

3. 阳性细胞筛选

　　这部分是细胞模型构建的关键部分。试想下，我们通过细胞转染技术将CRISPR/Cas9系统和模板DNA序列转入细胞中后，由于细胞内部机制的作用，我们得到的细胞池中既包含纯合子阳性细胞和杂合子细胞，又包含没有发生碱基突变的野生型细胞。那么，我们该如何挑选出目的细胞将是关键。对于点突变模型来说，由于没有引入抗性基因，常用的方法便是通过稀释法将细胞池细胞稀释转移到96孔板中，形成单克隆细胞。然后收集单克隆细胞进行大量测序，以得到预期的纯合子细胞。

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