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基因过表达技术:基因过表达载体构建|过表达质粒构建方法

2024-04-21

  基因过表达(gene overexpression)是将目的基因CDS克隆到相应的质粒或病毒载体上,利用载体骨架上构建的调控元件,使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译,从而实现目的基因的过表达。

  常见三种基因过表达:

  1. 常规蛋白表达

  常规的蛋白表达的同时可以为蛋白表达添加融合或非融合的荧光标签,亲和标签,亚细胞定位系列等一系列修饰。

  2. 非编码RNA表达

  与常规蛋白表达不同的是,由于非编码RNA(链接非编码RNA介绍)仅仅转录但不翻译,无蛋白产生,因此此类表达载体(尤其是lncRNA)最 好独立表达荧光蛋白,且常规蛋白表达的修饰基本不能使用。目前常见的非编码RNA主要为microRNA、lncRNA、circRNA三大类表达载体与之对应。

  3. 毒性蛋白表达

  细胞毒性蛋白表达与常规蛋白表达的载体除少量修饰外并无在明显区别,但在AAV载体制备过程中对表达的毒蛋白进行抑制才能产生。此载体主要用于过表达各种对细胞有毒害的蛋白。

  基因过表达细胞株技术背景

  许多研究者在研究基因功能时,会同时进行基因干扰和基因过表达,让实验结论更严谨。基因过表达是指通过慢病毒、电转等细胞转染方式,在细胞内提高特定基因的表达水平,从而实现基因的功能增强(gain of function),基因过表达作为一种传统的分子生物学技术至今依然在生物学研究中发挥着重要作用。

  基因过表达载体构建方法:

一套成熟稳定的基因干扰表达的实验体系,可针对多种不同细胞(包括难转染细胞)为您提供基因过表达稳转细胞株的构建服务。

  1、高调控效率

  可实现几十、百倍的过表达水平,经调控后的表达显著升高。

  2、性状稳定不恢复

  我们构建的过表达细胞株,经过十几代甚至更高的细胞传代后,仍然维持稳定的过表达性状。

  3、多种调控策略选择

  针对不同的基因和细胞特征,可优选不同的实验体系,达到最 佳调控效果。如:


实验方法

特点

慢病毒法

高感染效率,实现长期、稳定、显著的过表达效果。

转座子法

省去病毒包装和纯化过程,缩短实验流程;可装载上百kb的大基因片段。


  基因过表达实验流程:

  基因和细胞信息分析>目的基因合成>慢病毒载体构建>质粒转化>药物或荧光筛选>检测>细胞质检

  基因过表达载体应用

  1、进行基因功能的研究,提高目标基因的表达水平;

  2、可用于突变体的功能互补实验中,查看互补后能否恢复突变的表型,可按您的需求选择使用组成型表达强启动子或目的基因自身的启动子;

  3、转基因应用:例如通过DNA随机整合到小鼠基因组中获得基因工程小鼠模型,一般用于获得过表达或条件性过表达小鼠的制备。随着KI的效率越来越高,多数研究者已改用H11或Rosa26位点定点敲入的方式制作过表达小鼠模型。