基因打靶载体构建中同源臂长度设计

基因打靶载体的基本结构：中间为正筛选基因和相关序列，左右分别为长短同源臂以及在长同源臂外为负筛选基因。

设计载体时，需要在打靶位点两侧分别设计一段大小为几kb长度的同源臂，用于同源重组。大家普遍认为同源臂越长，重组效率越高。不过，也有研究用不到1kb的同源臂完成实验，而同时也有研究证实同源臂长度超过8kb后对于同源重组效率的提高就不再有明显的提高作用。

同源重组效率最主要还是由目标位点和打靶基因周围序列决定的，所以研究者现在普遍采用一长一短的适中长度同源臂设计方式，便于后期用PCR进行筛选以及最终的DNA印迹(southern blotting)检测确认打靶是否成功。短同源臂长度为2～3kb，而长同源臂为4～6kb。

ES细胞基因打靶和中靶克隆的筛选中同源臂设计

目研究者们将同源重组应用到ES细胞中从而获得了定点基因修饰的目的，通过将DNA片段导入细胞中，利用片段上的宿主细胞同源臂进行同源重组，将目的基因置换插入细胞基因组中整合表达。

在ES细胞中进行同源重组需要将打靶载体进行线性化后，通过诸如电转染(electroporation)、核转染等手段导入细胞中，研究已经证明线性化载体更有利于同源重组的发生。

目前，基因打靶事件的确定通常是首先用PCR反应筛选中靶的ES细胞克隆。PCR引物的设计原则是一个引物位于同源臂外，另一个引物位于载体内。用PCR扩增同源臂短臂，成功的基因打靶克隆会有扩增产物出现。阳性克隆还需要Southem blotting分析进一步验证。确定正确后，用于下一步的ES细胞显微注射，一体以产生嵌合体小鼠。

文章来源：中国实验动物信息网.基因敲除基本过程.https://www.lascn.net/Item/15524.aspx