技术资源

  • 基因编辑小鼠模型的敲除/表达检测

    由于基因表达和调控的复杂性和多样性,客户获得小鼠模型后,在大量扩繁前,应先对模型中目的基因的敲除/表达情况进行检测。可以通过 RT-PCR、Western blot、免疫组化等方法在 RNA 水平或者蛋白水平进行基因的敲除/表达检测。

    检测结果确认后,再进行大量的扩繁及表型实验等。


  • BAC转基因的优势和适用范围是什么?

    BAC(Bacterial Artificial Chromsomes,细菌人工染色体)转基因技术的优点是,携带的基因组片段大小为100-200kb,可以保留完整的基因及基因的调控区域,可以更加真实的模拟体内基因的表达情况。

    在以下情况下可选择该技术方案:

    ① 无法设计原位敲入方案

    ② 基因的调控区域未知

    ③ 无法确认启动子的组织特异性或者细胞特异性,或无可用的启动子

    ④ 需要表达基因很长,需表达基因的多个转录本或是全部家族基因时

    ⑤ 可与KO配合使用,实现基因的人源化/其他动物源化(通过引入BAC上的调控序列模拟来源动物目的基因的表达调控)


  • 转基因小鼠的优缺点及注意事项?

    对于普通的转基因,表达的区域将取决于启动子。如果选择全身表达的启动子,如CAG、EF1α、CMV等将得到全身表达的转基因小鼠;如果选择一些组织特异性表达的基因的启动子,将得到组织特异性表达的转基因小鼠,如在AP2的promoter启动下进行表达,会得到脂肪组织特异表达的转基因小鼠。需要特别说明的是,转基因的策略是将转基因片段直接注射到小鼠的受精卵中,转基因片段将会在小鼠基因组中进行随机插入,因为是完全随机的,有可能会插入到一些抑制区导致转入的基因不表达,也有可能插入到一些增强区导致转入的基因高表达,通常会出现在小鼠基因组中多拷贝插入的现象。通过原核注射的方法得到的第 一代转基因小鼠称为 founder(首建鼠),由于上述随机性,每一只founder都是不一样的,以每一只founder起源构建得到的可稳定遗传的品系称为line,不同的line之间的表达由于实际插入位点的不同和/或插入拷贝数的不同会有差异。首建鼠与首建鼠之间不应该相互交配。

  • 模型构建中可能发生的异常情况有哪些?

    若目标基因是生殖发育相关的重要基因,则全身敲除该基因后可能会导致阳性鼠死亡或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用条件性敲除的设计方案。

    如果基因有过表达致死或影响生殖的情况,则过表达模型(转基因或者安全位点敲入等)可能会发生表型,导致无法获得阳性小鼠,或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用诱导表达的设计方案。

    显性负效突变(Dominant negative mutation)类模型,杂合子小鼠便会出现表型,如果表型严重到影响到鼠生殖和发育的,可能无法获得阳性小鼠,或阳性鼠无法遗传。如果事先已知基因的功能,可采用诱导表达突变的设计方案。


  • 敲入模型片段插入在基因的N端还是C端?

    插入在N端还是C端要结合蛋白的结构域和蛋白的定位情况来综合考虑。插入位置尽量要避开蛋白重要的结构域,如果N端有分泌信号肽,可选择插入在基因的C端,但若实在需要插入在N端,可插入到信号肽的后面,但需要考虑插入外源序列后对信号肽切割效率的影响,此时可用 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 或类似的信号肽预测软件进行事先预测评估。

  • 设计模型时是否添加标签的考量是什么?

    我们在设计转基因或敲入小鼠模型的时候,如果表达的目标基因跟小鼠内源基因相同,或目前市面上没有较好的抗体来检测目的蛋白的表达时,可在设计载体时加入Tag。有多种标签可选择用于标记目的蛋白,常用的小标签有HA、Flag、Myc、His等,可用于蛋白检测、免疫沉淀等生化应用;常用的荧光蛋白有GFP、RFP、mCherry 、tdTomato等,可用于蛋白定位(包括亚细胞定位)和活细胞成像等(需要注意,通过2A肽段编码序列或IRES间隔的荧光蛋白不与目的基因表达产物形成融合蛋白,因此不能起到标签的效果,不能反应蛋白的亚细胞定位或作为标签使用,仅能标示目的基因的时序性和组织特异性表达)。需要注意的是,Tag加入后可能会对基因的表达或蛋白的功能产生无法预期的影响,一般来说蛋白标签分子越大,影响可能会越大。

  • F0代或嵌合鼠为什么需要与背景鼠回交?

    F0代或嵌合体小鼠中的修饰基因非稳定可遗传,可能生殖系细胞并未被进行编辑因而无法遗传获得阳性后代;可能在一只鼠身上存在多种不同的编辑类型,导致传代后的小鼠基因型不正确或存在多种不同的基因型;每只F0代鼠的情况均不同。为了得到稳定可遗传的基因编辑小鼠,需要将F0代或嵌合体与野生型背景小鼠回交,得到阳性F1代杂合子。转基因品系由于存在多位点多拷贝随机插入的情况,F0代founder鼠可能需要回交多代才能实现稳定。

  • 各项模型中的质控方案是什么样的?

    在各类项目的载体构建的阶段,每一步都需经过PCRà酶切à测序的过程,确保载体的正确性。

    在小鼠阶段,采用对5-7天的小鼠进行剪尾鉴定,同样是经过PCR测序的检测过程, 保证KO/CKO/KI模型正确中靶,并且中靶序列正确。KI类模型还有严格的拷贝数检测,确保除了正确中靶的序列外,无额外的随机插入片段。


  • 模型定制服务最后交付给客户的内容?

    我们最终会为客户提供至少3只经过鉴定为阳性的杂合子小鼠(转基因为至少3只founder小鼠)。在项目完成得到足够数量的杂合子小鼠后,我们会将该项目的项目完成报告、小鼠使用手册、鉴定体系说明一并发送给客户。

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