技术资源

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  • 鉴定服务与寄送标准

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  • 常见问题及解决方案

    1、PCR假阴性(扩增条带弱或无条带)


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    A 特征

        ●  样品目的条带无法扩增或条带弱;

        ●  阳性对照同样没有条带或条带极弱;


    B  原因

        ●  目的片段条带过大导致扩增效率低;

        ●  未完全重复我方扩增体系(酶、DNA提取、程序等);

        ●  PCR仪温控模块差异;


    C  解决方式

        ●  设计备用引物,尽量缩短PCR产物大小;

        ●  完全按照我们的体系来进行鉴定;

        ●  由于仪器、操作等环节依然存在变量,若上述处理无法改善,建议梯度测试最优退火温度。


    2、PCR假阴性(泳道弥散状、伴随核酸挂孔现象)


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    A  特征

        ●  胶孔大量发光,DNA无法脱离胶孔;

        ●  泳道出现弥散状抹带,通常伴随挂孔现象;


    B  原因

        ●  DNA通过碱裂解、一步法试剂盒提取,未经纯化使用,蛋白裹在核酸上,导致核酸无法跑出胶孔;

        ●  DNA模板附着较多杂质,影响引物的退火结合;

        ●  弥散的泳道通常为一些降解的核酸片段;


    C  解决方式

        ●  稀释DNA模板,降低杂质比例;

        ●  重新纯化提取DNA模板(乙醇纯化、离心柱纯化等);

        ●  及时电泳,避免扩增产物长时间存放室温或4℃冰箱。


    3、PCR假阳性(出现污染)


    A  特征

        ●  阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带,通常会稍弱于阳性样品的主带,偶有与主带完全相同的亮度;

        ●  常发生于PCR产物小于500bp的反应中,产物越小,污染可能性越高;


    B  原因

        ●  样品交叉污染,包括DNA模板、扩增体系配置或者电泳时污染;

        ●  气溶胶污染,少量样品鉴定时偶发,大批量样品鉴定、或者长时间使用同一对引物鉴定时发生频率明显增高;


    C  解决方式

        ●  轻微污染时,提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行;

        ●  污染严重时,重新设计备用引物检测,条带不小于500bp,同时使用上述调整体系。


    4、PCR特异性差(存在非特异性条带)


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    A  特征

        ●  除目的条带外,存在其他特异性扩增的产物,有时非特异性产物与目的带接近,影响结果判定;


    B  原因

        ●  引物不特异;

        ●  酶的效率太强、退火温度偏低、退火延伸时间过长;



    C  解决方式

        ●  非特异性扩增条带较弱时,提高退火温度、减少3-5循环、稀释DNA模板同时进行,可有效抑制非特异性扩增;

        ●  非特异性扩增条带较强时(杂带亮度与目的带几乎一样或者更亮),重新设计PCR引物。


    5、PCR优势扩增


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    A  特征

        ●  PCR发生优势扩增,两条带的亮度不同,甚至可能有一条带完全无法扩增;


    B  原因

        ●  当一个PCR反应中存在超过一种产物时,不同的产物会存在竞争性扩增,导致其中一种产物的产量远大于其他产物;

        ●  通常小条带比大条带更容易扩增,且两条带差距越大,优势扩增现象越明显;

        ●  个别情况下,比如产物序列存在特殊结构,也会出现大条带优势扩增现象;


    C  解决方式

        ●  集萃药康鉴定方案为避免优势扩增干扰,通常两条带差距超过300bp,会分别设计引物用于验证,避免优势扩增出现。


    6、电泳条带弯曲


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    A  特征

        ●  电泳结果出现“笑脸状条带”;


    B  原因

        ●  制备琼脂糖凝胶时,煮沸后部分水分蒸发,导致琼脂糖凝胶中的电泳液浓度,高于电泳槽中的电泳液浓度。此时胶孔中的PCR产物,中心区域迁移速率快,周围靠近电泳液的产物迁移速率慢,展现出严重的弯曲;


    C  解决方式

        ●  煮沸凝胶后,需要添加蒸馏水,补足蒸发的体积,需要注意缓慢添加,并同时均匀晃动,避免局部降温过快,导致凝胶冷却不均匀产生结块。